酶反映中如何由米氏常數和轉化率,初始濃度推算最大反映速率

實驗原理1913年，Michaelis和Menten運用酶反應過程中形成中間絡合物的原理，首先提出了底物濃度和酶促反應速率的關系式，即著名的米氏方程：?SKSVvmmax式中：v為反應初速率（微摩爾濃度變化/min）；Vmax為最大反應速率（微摩爾濃度變化/min）；?S?為底物濃度（mol/L）；Km為米氏常數（mol/L）。這個方程式表明當已知Km及Vmax時，酶反應速率與底物濃度之間的定量關系。Km值等於酶促反應速率達到最大反應速率壹半時所對應的底物濃度，是酶的特征常數之壹。不同酶的Km值不同，同壹種酶與不同底物反應Km值也不同，Km值可以近似的反應酶與底物的親和力大小：Km越大表明親和力越小；Km越小表明親和力越大。大多數純酶的Km值在0.01?100?mmol/L。通過米氏方程的不同變形，可有多種求算米氏常數的方法，壹般較常用的雙倒數法，即取米氏方程的倒數式：?maxmaxmV1S1VKv1以v1對?S1作圖得壹直線，該直線與橫軸截距?mK1S1?。?過氧化物酶是壹種對氫受體（H2O2）?底物有特異性，對氫供體底物缺乏特異性的酶，它可催化過氧化氫氧化許多多元酚或多元胺類底物發生顯色、熒光或化學發光反應，可用於微量過氧化氫含量測定，也可以和其它酶反應系統偶聯可用於測定許多與生命相關的物質：如葡萄糖、半乳糖、氨基酸、尿酸及膽甾醇等，亦是免疫分子和核酸分析中常用的標記物。通常使用的過氧化物酶是從植物辣根中提取的，因此也稱為辣根過氧化物酶（horseradish?peroxidase,?HRP）。HRP屬於含血紅素蛋白的壹種，是由輔基——氯化血紅素（鐵卟啉）和脫輔基蛋白（糖蛋白）組成，分子量為44000。?HRP是雙底物酶（過氧化氫+多元酚或胺類底物），為求其對某壹底物的Km，通常的做法是令另壹底物的濃度相對於待測底物大大過量，即可把該酶促反應當作單底物反應來處理。本實驗我們選用3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺（TMB）作為氫受體，它可被Hb催化過氧化氫氧化生成有色產物，該產物在反應條件下（pH5-7左右）為藍色物質（?max=650?nm）。實驗中我們使TMB的濃度大過量，測定HRP對H2O2的Km值（反之亦可測定HRP對TMB的Km值）