幹細胞培養的幾個概念

金安徽農業大學畜牧與水產學院？自從Evans和Kaufman(1981)從延遲著床的胚胎中分離出小鼠胚胎幹細胞(ES細胞)以來，ES細胞就備受關註？〔1〕?。從65438到0998，基隆公司資助的湯姆森研究小組在《科學》雜誌上發表了壹系列關於建立人類es細胞的工作後，基隆的股票暴漲了6倍。1999和2000年期間，幹細胞研究兩次被美國《科學》雜誌推薦為21世紀最重要的研究領域。從65438到0999，美國《科學》雜誌也將幹細胞研究評為當年世界十大科學成就。這足以說明幹細胞的魅力，而幹細胞之所以吸引人們的目光，主要是因為幹細胞是壹種全能性細胞，可以自發分化為多細胞結構，即胚胎體(EB)。EB包含三個胚層:外胚層、內胚層和中胚層。胚胎小體可以繼續分化形成多種細胞類型，包括血細胞、內皮細胞、肌細胞和神經元。此外，ES細胞在動物克隆生產、轉基因動物生產、疾病研究模型和藥物生產中具有誘人的前景。本文主要闡述了胚胎幹細胞在克隆動物生產中的應用。？1 ES細胞克隆的理論基礎是什麽？胚胎幹細胞是從早期胚胎的內細胞團和原始生殖細胞中分離出來的壹種細胞。它具有全能性或多能性，可以發育成任何壹種組織或器官的前體細胞，然後由前體細胞發育成功能細胞。正常的ES細胞可以分化成兩個子幹細胞，或者壹個子幹細胞和壹個功能細胞。這種分化受幹細胞內源性調節(主要受幹細胞中的結構蛋白和多肽因子)和外源性調節(主要受周圍組織細胞和細胞外基質)的影響。最近，Amato Giaccia發現氧含量操縱幹細胞的分化，這為人們進壹步利用幹細胞提供了有益的提示。另壹個重要發現是，Andrew E. Wurmser等人發現，來自成熟組織的幹細胞只是與現有細胞融合形成其他組織，而不是制造新的細胞，因此使用來自成熟組織的幹細胞會趨於更加謹慎？〔2〕?。這也進壹步增強了es細胞的作用。？ES細胞的另壹個特點是可以像正常體細胞壹樣在體外增殖、克隆、冷凍和保存，無需分化。這樣就可以為人們提供大量可用的ES細胞。比如每只實驗動物壹次可以提供5000 ~ 6500個PGC，然後可以在體外培養成類ES細胞。現在人們可以通過體外培養ES細胞到40 ~ 60代而不分化，如此大量的細胞為我們使用奠定了基礎。？胚胎幹細胞是可操作的。在體外，人們可以進行基因操作選擇，如轉基因、基因打靶、基因誘捕等壹系列技術，結合核移植技術，生產出想要的動物。？克隆2個ES細胞可行嗎？克隆技術的原理是將供體細胞核移植到去核卵母細胞中，通過激活重新編程，從而產生新的個體。目前體細胞克隆與ES細胞相比存在兩個問題:壹是體細胞在體外容易發生變異。為了避免這壹缺點，通常使用最近分離或傳代的細胞。第二個是關於在哪裏選擇細胞。目前，人們已經利用乳腺細胞、卵丘細胞、輸卵管細胞、皮膚成纖維細胞、子宮上皮細胞、肌肉細胞、支持細胞、肝細胞、耳成纖維細胞、初乳中的乳腺上皮細胞等。但到目前為止，還沒有發現體細胞是最適合核移植的。壹些用於核移植的細胞來自胎兒，通常是成纖維細胞，還有壹些來自成年動物。這主要是因為雖然理論上，體內的每壹個細胞都是從壹個受精卵分裂分化出來的，DNA信息在體內完全是通過半保守復制的方式傳遞的，但從壹個受精卵到體內數億個細胞，部分細胞的個別基因可能會發生不可逆的丟失或重排。用這樣的細胞做核供體，信息的完整性無法保證，這也可能是細胞克隆效率低，出生後死亡或異常的原因之壹。雖然ES細胞的核移植也需要在去核卵中進行重編程，但是ES細胞的克隆效率要比效率低下且容易在妊娠期流產的體細胞克隆高得多，ES細胞的重編程也容易得多。還假設存活的克隆個體使用的大部分供體細胞核是來源於動物組織的成體幹細胞的細胞核，而不是最終分化細胞的細胞核。。？隨著對ES細胞研究的深入，人們已經在許多動物中獲得了ES細胞核移植的後代。Teruhiko Wakayama等人從傳代30代以上的小鼠ES細胞中克隆出31小鼠，其中14小鼠存活[4]？；坎貝爾(1996，1995)將類ES綿羊和山羊分別註射入去核卵母細胞，獲得重構胚，核移植後出生活羊。〔5〕?。Michelle Sims和N. L First (1993)將培養6 ~ 101d的牛ICM細胞核移植到去核卵母細胞中。卵裂率為70%，囊胚率為24%。胚胎移植後，有13次懷孕，生了4頭小牛？〔6〕?；Stice(1996)通過牛類ES細胞的核移植獲得重構胚，並將其移植到受體牛子宮中，在那裏發育45天？〔7〕?；奇貝利利用轉基因技術獲得了嵌合種系的牛；Shim(1997)和Piedrahita(1998)建立了來自豬PGCs的多能幹細胞系，並獲得了嵌合豬。？3 ES細胞克隆的意義是什麽？es細胞核移植最基本的意義在於，如果核移植能夠產生完整的後代，並且具有與其親本相同的遺傳特征，那麽恰恰證明了ES細胞是壹種全能性細胞。ES細胞克隆與體細胞克隆壹樣，通過獲得大量與其親本具有相同遺傳特征的供體細胞，然後利用核移植技術，可以提高優秀個體的繁殖效率，迅速擴大優秀個體的種群，為畜牧業生產做出巨大貢獻。對於稀有物種或瀕危物種，這項技術提供了拯救稀有或瀕危物種的機會。在胚胎幹細胞水平使用基因操作比在受精卵水平進行轉基因更容易，人們可以獲得他們需要的轉基因動物。然後利用核移植技術可以獲得大量具有這種基因表達的個體，這也是創造新物種的絕佳機會。因為ES細胞具有自發融合的性質，可以在細胞水平上運作，創造出新的物種，這可能是自然交配得不到的。先後將牛、羊和人的GH基因導入小鼠基因組，在快速生長期獲得的轉基因小鼠生長速度是對照組的4倍。此外，利用胚胎幹細胞核移植可以壹次獲得大量同質後代，這為生物學研究提供了很好的模型。4目前存在哪些問題？由於ES細胞的發現只有20多年的歷史，人們對它的了解有限，限制了它的利用。目前就幹細胞核移植而言，主要存在以下問題:4.1核移植技術本身還有很多理論有待完善，核移植的效率目前還很低，重構胚的發育和植入、核質的相互作用和協調等理論還需要進壹步深入研究。？4.2建立胚胎幹細胞系的技術尚不成熟。目前廣泛使用的飼養層是由小鼠成纖維細胞無限系(STO)或小鼠胚胎成纖維細胞(PMEF)制成，主要是利用其細胞分泌的生長因子FGF和抑制細胞分化的因子LIF***來阻止幹細胞在體外克隆而不分化，再加入壹些其他物質。即便如此，目前建系效率仍然不是很高，尤其是在國內，能獲得的類ES動物不多，傳代次數少。目前，人們嘗試使用其他培養基，如大鼠成纖維細胞條件培養基、山羊輸卵管上皮培養基、綿羊輸卵管上皮培養基、綿羊子宮上皮培養基、山羊子宮上皮培養基、牛顆粒細胞培養基、牛子宮成纖維細胞培養基、胎牛睪丸、腎和肝成纖維細胞培養基。Meinecke Tillmann(1996)發現胎牛成纖維細胞有利於綿羊ICM和ES細胞的增殖。Piedrahitat等人用豬胎兒成纖維細胞和上皮細胞作為飼養層，結果失敗。Strojek等(1990)認為豬子宮成纖維細胞的飼養層可以促進囊胚的粘附和ICM克隆的形成。此時，如果以STO為飼養層，雖然豬囊胚可以附著STO，ICM不增殖，但後續傳代只需要STO。可見，飼養層的選擇還有待進壹步發現。對於ES細胞的建立，人們還發現ES細胞必須保持壹定的濃度，因為ES細胞既能從培養基中吸收營養物質，又能將自身的分泌物和代謝產物等物質排入培養基中。在這些分泌物中，有促進細胞生長的物質，有人稱之為克隆生長物質。？ES細胞的應用範圍很廣，核移植的應用只是其中的壹部分。比如利用ES細胞的全能性，定向誘導分化，然後在細胞層面進行藥物測試，可以大大提高藥物測試的進度；利用胚胎幹細胞，可以建立人類遺傳病的動物模型。可以說對幹細胞的研究方興未艾。？參考資料？〔1〕Evans M J，Kaufman M H .小鼠胚胎多潛能細胞培養體系的建立〔J〕自然，1981，292(9): 154~156？〔2〕Andrew E. Wurmser，Fred H.Gage .細胞融合引起混亂〔J〕。自然，2002，416，485~491？〔3〕康拉德·霍切林格，魯道夫·耶尼施。成熟B和T供體細胞核移植產生的單克隆小鼠〔J〕自然，2002，415，1035~1038？〔4〕Wakayama T，Rodriguez I，Perry AC，等.從胚胎幹細胞克隆的小鼠〔J〕美國國家科學院院刊，1990，96(26):14984~14989？〔5〕坎貝爾。K.H.S，Mc whiir，J .裏奇。從培養細胞系中通過核移植克隆綿羊〔J〕。Natrue，1996，38(7):64~66？〔6〕西姆斯M.M，菲爾莎妮。從全能性培養的牛內細胞團細胞生產胎兒。生殖學，1993，39:313？〔7〕Stice SL，strolchonko NS。多能牛胚胎細胞系遵循生殖核移植生物學指導胚胎發育。動物發生學，1996，54:100~110