近日，《化學科學》在線發表的壹項研究成果顯示，來自北京大學和西湖大學的研究人員共同開發了兩種新型探針，PK米托紅(PKMR)和PK米托深紅(PKMDR)，首次在活細胞水平上顯著降低了光毒性。
21世紀被認為是生命科學的時代。為了進壹步揭開細胞生物過程的奧秘，科學家們發展了各種生物成像技術。其中，熒光超分辨成像因其成像條件簡單、與生物樣品兼容而脫穎而出。
突破超分辨率成像中的“卡脖子”問題
早在2065438+2008年，北京大學分子醫學研究所陳等人開發的Hessian SIM首次揭示了活細胞內線粒體的精細內脊結構及其動態變化。
為了滿足新型光學顯微鏡的需求，國內外許多科研團隊開發了多種新型光穩定線粒體探針，用於觀察線粒體內脊的結構。
但是，超分辨率成像所需的高激發強度往往使得線粒體熒光探針更容易產生活性氧(ROS)，這種活性氧不會隨著采樣時間的增加而消失。
這樣的超分辨率成像，即使熒光探針本身沒有完全漂白，也會迅速破壞線粒體的內脊，使線粒體腫脹變圓。
“光毒性雖然對光學分辨率沒有影響，但會對細胞結構產生很大影響，細胞會受到損傷甚至被殺死。在這種情況下，妳看到的和生理反應完全不壹樣。”
這項工作的通訊作者之壹、北京大學分子醫學研究所研究員陳誌興告訴《中國科學報》。
換句話說，活細胞超分辨率成像要解決的主要問題其實是提高光毒性，而不僅僅是光漂白。
針對該領域的新痛點，陳誌興團隊利用環辛四烯分子內共軛的策略，成功合成了兩種新型低光毒性線粒體熒光探針——PKMR和PKMDR，首次在活細胞水平實現了光毒性的顯著降低。
此外，的團隊還與西湖大學的陳、團隊和團隊進行了合作。通過進壹步的實驗證明，這種新型染料對細胞的光毒性明顯低於市售的MitoTracker系列染料，可以實現1000幀以上、線粒體內脊形狀基本不變的超分辨率成像。首次證明該探針可用於渦蟲的幹細胞流分選而不影響幹細胞的多能性，可真正用於研究幹細胞重編程等生理過程中的線粒體功能。
低光毒性更溫和
據陳誌興介紹，熒光探針的光毒性壹般來自於激發過程中第壹激發態單線態(S1)產生的第壹激發態三線態(T1)，T1與氧相互作用可生成單線態氧等活性氧，從而破壞生物分子。
為了最大限度地抑制這壹過程，降低光毒性，團隊采用了分子內共軛三重態猝滅劑(自修復染料)的策略，這種策略此前被應用於染料激光、單分子成像等領域，以減少光漂白。
HeLa細胞的光存活實驗表明，只有環辛四烯(COT)能有效降低熒光成像中的光毒性。
更重要的是，研究小組還觀察到，可以減少光漂白(硝基苯)的基團不壹定會減少光毒性。
正因為如此，“熒光探針的光毒性和光漂白特性應該分開測試，但在以前的熒光探針設計中，往往忽略了對探針光毒性和其他特性的詳細表征。”陳誌航解釋道。
在此基礎上，團隊以COT為三重態猝滅基團，合成了以菁為母核的兩種熒光探針PKMR和PKMDR。
HeLa細胞的光存活實驗表明，新探針的光毒性沒有相應光譜的商用探針(MitoTrackers)的1/5高，在相同條件下可以提供相同甚至更高的亮度。
“可以說這項工作為該領域找到了新的方向，有望在未來將探針的光毒性降低到較低水平甚至完全消除。”陳誌興說。
協同創新走向極致
2065438+2008年6月，陳誌興回國後加入北京大學分子醫學研究所。
當時，陳團隊研發的Hessian SIM不僅將光學顯微鏡的性能提升到了壹個新的高度，而且從數學和物理兩個方面大大提高了超分辨率成像技術的光毒性。
要把超分辨率成像技術做到極致，必須從化學探針方向進行協同創新。
化學研究出身的陳誌航的加入，無疑給團隊註入了強大的動力。
從2065438年6月到2008年6月，探針研究取得了重要突破。團隊只用了1多年，卻叠代了三代設計，終於找到了有效的方案。
長期從事幹細胞再生研究的雷凱團隊在測試了新探針在幹細胞分選領域的應用後，發現用新探針標記的線粒體有助於分選幹細胞，用新探針標記的幹細胞在體外仍能保持良好的活性和幹燥度，充分展示了其在流動熒光分析分選中的優良生物相容性。
更重要的是，新探頭在遠程超分辨率成像方面也表現出了優異的優勢。
Hessian SIM的成像結果表明，新探針提供了接近2D Hessian SIM理論值的分辨率，顯示了清晰的線粒體脊結構圖像，同時最大程度地保留了線粒體的原始形狀。
而商業染料MitoTracker Red CMXRos (MTR)標記的線粒體在140幀左右腫脹明顯變形，200幀以上看不到脊等正常生理結構，而PKMR標記的線粒體在1000幀以上可以提供健康的線粒體圖像，2000幀左右的線粒體變形程度仍小於200幀的商業探針。
“下壹步，我們將繼續在數學、物理和化學方面共同努力，將技術推向極致。同時，未來爭取轉型，打破國外公司在高端影像儀器/探頭方向的壟斷，真正為生物醫學科研人員提供超越國外產品的國內高端影像工具。”陳誌興說。
相關論文信息:
https://doi.org/10.1039/D0SC02837A
《中國科學報》(第三版，2020年9月7日)