壹種簡單有效的克隆未知側翼DNA片段的方法
中國基因網宋寶亮齊李瑋梁博
宋寶良(中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所分子生物學國家重點實驗室，上海，200031)
中國科學院上海生命科學研究所生物化學與細胞生物學研究所分子生物學國家重點實驗室，上海，200031；南京大學生物科學與技術系，南京，210093)
李(中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所分子生物學國家重點實驗室，上海，200031)
摘要:為了克隆含有長插入片段的DNA，常常需要進行亞克隆和測序實驗。通常的方法是獲得插入片段的限制性內切酶譜，然後選擇合適的內切酶消化DNA，分離出目的片段，連接到質粒載體中進行下壹步操作。但是這種方法工作量大，步驟復雜。這裏介紹壹種不需要做限制性內切酶譜分析的方法。亞克隆實驗直接根據目的片段的側翼序列進行。首先，選擇合適的限制性內切酶來消化含有長插入片段的DNA克隆，其中壹個在已知側翼序列上切割，另壹個隨機選擇。然後，將酶消化的混合物與線性化的質粒載體連接，通過轉化細菌獲得“亞克隆文庫”。在選擇克隆並在96孔板中培養後，通過按行或列混合細菌液獲得相應的“庫”。最後，通過PCR篩選含有靶DNA片段的陽性克隆，其中壹個引物與已知側翼DNA序列配對，另壹個與質粒載體配對，通過PCR擴增已知側翼DNA片段以鑒定陽性克隆。大量獨立實驗表明，該方法簡單有效，可廣泛應用於亞克隆和DNA步移實驗。
妳也可以使用PCR
第五節PCR異地應用模式
1.用簡並引物進行PCR。
密碼子被合並，如表22-4所示。僅通過氨基酸序列推斷編碼的DNA序列並不準確，但可以設計成壹對合並引物，擴增編碼已知序列的所有核酸序列。當使用合並引物時，寡核苷酸中核苷酸序列可以改變，但是核苷酸的數量應該相同。合並程度越低，產品的專用性越強。設計引物時，應盡量選擇合並率低的氨基酸，避免引物3’端的合並。用於合並的混合引物已經成功地用於未知靶DNA的擴增、克隆和序列分析。目前，已成功克隆了豬尿酸氧化酶基因、哺乳動物和家禽的糖尿病相關肽基因和嗜肝病毒基因。脫氧肌苷(脫氧肌苷；DI)帶引物的PCR可以替換編碼蛋白質的各種合並密碼子中的合並堿基，DI的特異性主要受cDNA濃度的影響。
表22-4密碼合並
氨基酸
密碼子數量
m、W
1
c、D、E、F、H、K、N、Q、Y
2
我
三
a、G、P、T、V
四
l、R、S
六
註意:選擇肽鏈時最好避免4 ~ 6個密碼子的氨基酸。
第二，嵌套引物)PCR
用第壹套引物擴增15 ~ 30個循環，再用擴增DNA片段中設置的第二套引物擴增15 ~ 30個循環，使待擴增序列得到高效擴增，但二級結構很少擴增。使用初始引物限制法或Centricon30(Amicon)分子過濾器離心，並在添加第二套引物之前去除第壹套引物。該方法已成功地用於分析中國倉鼠卵巢AS52的分子突變。AS52細胞含有單拷貝的細胞GPT(鳥嘌呤磷酸核糖核酸酶)基因，其與哺乳動物具有同源性。巢式引物PCR減少了引物的非特異性退火，從而增加了特異性擴增，提高了擴增效率。對於環境樣品中的微生物檢測和單拷貝基因靶DNA的擴增非常有效。
如果巢式PCR的內外引物稍有變化，外引物長度延長(至25 ~ 30bp)，內引物長度同時縮短(15 ~ 17bp)，使外引物在高溫退火溫度下擴增，然後改為三溫循環，內引物在外引物擴增的基礎上進行低溫三溫循環，直至擴增完成。兩個循環同時完成，相當於只進行壹次PCR，靈敏度與巢式二次PCR相同。所有程序都可以在我們最近推出的PTc 51氣流DNA熱循環儀上完成。
巢式壹次PCR的成功，使PCR檢測的全過程在5小時內完成，使當天的檢驗報告成為現實，也為PCR檢測進入臨床提供了現實基礎。
第三，多重PCR(Multiplex PCR)
用多對引物同時擴增幾個DNA片段的方法稱為復合PCR。這種方法最初是由Chanberlain等人開發的，用於檢測人類基因。Bej等人隨後開發了壹種檢測方法，用於同時PCR擴增與環境樣品中不同屬細菌相關的基因序列。兩個不同的軍團菌基因，壹個是特異性嗜肺L基因(mip ),另壹個是L-5SrRNA基因，通過交錯添加引物進行組合。首先用mip引物進行7個循環的PCR擴增，然後加入5SrRNA引物進行38個循環的PCR擴增。加入不同量的LacZ和LacB基因引物進行PCR擴增，可以檢測大腸桿菌和與人體糞便汙染相關的細菌，包括大腸桿菌、腸致病性沙門氏菌和誌賀氏菌。
在多重PCR中，所有引物的Ta值應該相似。如果兩對引物的Tq值之差超過10%，擴增產物的量就會明顯不同，很難觀察到其中壹個擴增產物或目標DNA。此外，目標DNA的長度應該相似。當差異較大時，短片的目標DNA會先被擴增，因此會產生不同產量的擴增產物。因此，有必要使用DNA擺動擴增或添加不同的引物來解決問題。
四。反向PCR(反向PCR或反向PCR)
反向PCR的目的是擴增已知序列側翼的DNA，也就是說，這個反應系統不是在壹對引物之間而是在引物之外合成DNA(見圖22-2)。反向PCR可用於研究與已知DNA片段相連的未知染色體序列，因此也可稱為染色體慢化或染色體步行。此時，盡管選擇的引物與核心DNA區域兩端的序列互補，但兩個引物的3’端彼此相反。擴增前，用限制性內切酶消化樣品DNA，然後用DNA連接酶連接成環狀DNA分子，用反向PCR擴增引物的上下遊片段。目前已經制備了酵母人工染色體(YAC)大線性DNA片段的雜交探針，這對於確定轉座子插入序列和鑒定基因庫染色體上的DNA片段序列非常重要。
這種方法的缺點是:①需要從眾多酶中選擇限制性內切酶，或者必須選擇壹種合適的酶進行酶切，以獲得大小合理的DNA片段。這種選擇不能在非限制性位點切斷靶DNA。②大部分有核基因組含有大量中度和高度重復序列，有時在YAC或粘粒中的未知功能序列中發現這些序列，使反向PCR得到的探針可能與多個基因序列雜交。
反向PCR可以用來分析擴增後的未知序列，探索與已知DNA片段相鄰的序列，分子克隆只有部分序列的全長cDNA，建立全長DNA探針。適用於研究已知序列的DNA側翼病毒的基因遊走、轉座因子和整合位點分析。
圖22-2反向PCR原理示意圖
波浪線代表靶DNA，正方形代表尋翼序列,▲和△代表限制酶定位。
點，寡核苷酸引物和模板的互補位置用平箭頭標記。
五、不對稱PCR(Asymmetric PCR)
不對稱PCR的基本原理是利用壹對不對等的引物產生大量的單鏈DNA(ss-DNA)。這兩種引物分別稱為限制性引物和非限制性引物；最佳比例壹般為1: 50 ~ 1: 100，關鍵是要限制引物的絕對量。限制性引物過多和過少都不利於ss-DNA的制備。也可以用普通PCR制備靶DNA雙鏈DNA(ds-DNA)，然後以ds-DNA為模板，只用過量引物中的壹條，通過單引物PCR制備ss-DNA。
生成的ds-DNA和ss-DNA由於分子量不同，可以在電泳中分離，得到純的ss-DNA。
不對稱PCR主要用於制備ss-DNA用於測序。特別是CD-Na不對稱PCR是壹種研究真核DNA外顯子的好方法。
六、標記PCR(LP-PCR)和彩色PCR。
Lp-PCR(標記引物PCR)使用同位素、熒光素等。標記PCR引物的5’末端，從而檢測目的基因的存在與否。與常規PCR相比，LP-PCR更加直觀，省略了限制性內切酶消化、分子雜交等復雜步驟，可以同時分析多個基因成分，因此特別適合大量臨床樣本的基因診斷。目前這種方法只能定性鑒定PCR產物。
Color PCR(Color complement assay)直譯為“顏色互補檢測”，是LP-PCR的壹種。彩色PCR的自由翻譯更加明確:它用熒光染料標記引物的5’端。熒光染料喬和FAM是綠色熒光；TAMRA是紅色熒光；COUM是藍色熒光。不同熒光標記的引物同時參與反應，擴增的目的基因會分別攜帶引物5’端的染料。通過電泳或離心沈澱，肉眼可以根據不同熒光的顏色判斷目的基因是否存在以及擴增基因的類型。通常只需要兩條顏色不同的引物，其中壹條作為基因檢測引物；另壹種作為內部控制條件，可以診斷基因缺失、染色體易位或病毒感染。檢測多點突變時，可以使用更多的顏色，如多點突變的遺傳病、幾種可疑病毒感染和HLA位點分析，彩色PCR可以同時檢測多個位點。
七、加PCR。
Add-PCR是將DNA序列添加到擴增產物的5’末端的PCR。當設計用於end-PCR的引物時，除了與模板配對的部分之外，還添加了幾個堿基，以便在擴增產物的末端添加額外的DNA片段，例如限制酶的識別序列或特定功能的DNA片段。Stoflet等報道噬菌體T7的啟動子加在結構基因之前，但也可用於標記DNA片段的末端或引入特定的點突變。末端可以添加的堿基數量與引物的長度有關。當引物足夠長時，甚至可以在擴增產物或末端添加十到幾十個堿基。
八、錨定PCR或固定PCR。
PCR(錨定PCR，A-PCR)主要用於分析末端可變的DNA序列。Loh等人用A-PCR分析了人外周血淋巴細胞T細胞受體α鏈mRNA的變異性。首先，合成cDNA，並通過末端脫氧核苷酸轉移酶在其3’-可變區末端添加PolyG尾。壹個引物設置在恒定區和可變區如Loh的交界處，另壹個引物是具有5’-polyG尾的引物。帶PolyG尾的引物是壹個固定點，可以和PolyG尾結合，只識別片段的末端，不考慮其他部分的序列。利用這種方法，可以從上述mRNA中檢測出至少20種不同的序列，每種序列都是唯壹的，說明A-PCR並不偏向於任何特定的序列，可以用於T細胞、腫瘤等部位抗體基因的研究。
九、玻片PCR
在聚丙烯管中，各種含有膜板的材料都可以進行PCR，直接用顯微鏡載玻片上的組織塗片或切片進行DNA擴增的方法稱為PCR(Slide-PCR。
圖22-3錨定PCR原理示意圖
將細胞塗片或單層細胞，然後用甲醇/乙酸(3: 1，V/V)、卡諾伊溶液、無水乙醇或4%多聚甲醛溶液固定5 ~ 15 min。用蒸餾水沖洗，幹燥，直接使用或儲存在-20℃備用。在載玻片上畫20mm×28mm作為免疫組化反應區。加入30μL PCR反應混合物，其包含100 mmol/L tris pH 8.3、50 mmol/L KCl、1.5 mmol/L MgCl2、200μ mol/L DNTPS、100 nmol/L引物和0.01%(V/V)。然後蓋上22mm×40mm的蓋玻片，用石蠟油封邊。將載玻片放在PCR熱循環儀的金屬塊上，使金屬塊與樣品最大程度地接觸，像在聚丙烯管中壹樣進行30 ~ 40次循環。對於較短的擴增片段，可以在後期循環中降低變性溫度。反應結束後，將冷卻的載玻片放入氯仿中除去大部分石蠟油，但不要取出蓋玻片。用鋒利的鑷子輕輕夾起蓋玻片的壹角，對面壹角的PCR反應液為半月形液面，用移液管回收。壹般可回收25μl的混合液，反應產物可通過瓊脂糖電泳或巢式PCR引物的標準PCR重新擴增。芯片上的擴增子可以通過原位雜交展示。
在Slide-PCR中，需要0.1% ~ 1%的BSA。加入BSA可以保證擴增結果，但效率不壹定高。明膠(至少0.0001%)對於擴增1kb左右的目的DNA非常重要。但對小片段的擴增結果影響不大。不同的樣品提取方法或固定方法對於Slide-PCR是可行的。
Silde-PCR的機理可能是在最初的變性過程中從細胞中洗脫出壹部分DNA，然後在細胞和載玻片的水相中進行PCR。地高辛標記的人類全基因組DNA探針的雜交顯示，DNA在初始循環中極其微量，但在30個循環後豐富。常規細胞染色僅顯示少量形態學變化。
Silde-PCR為載玻片上的細胞樣品提供了更好的方法，並且不需要從載玻片上封閉這些樣品，因此操作簡單並且減少了汙染。這種方法對於極少量的需要跟蹤保存的原始樣本(如宮頸塗片或塗片)具有實用價值。
X.逆轉錄聚合酶鏈反應檢測RNA
RNA的聚合酶鏈式反應(RT-PCR)是逆轉錄-反應(RT)和PCR的結合，可用於檢測單個細胞或少數細胞中少於65，438+00拷貝的特定DNA，為RNA病毒檢測提供了便利。它還提供了壹種極其有利和有效的方法來獲得與特定RNA擴增互補的cDNA。
RNA擴增包括兩步:①互補鏈cDNA的合成；在單引物的介導和逆轉錄酶的催化下進行RNA的轉錄；②加熱後，cDNA從RNA鏈上解離下來，然後與另壹個引物退火，DNA聚合酶催化引物延伸生成雙鏈靶DNA，最後擴增靶DNA。
RT-PCR的關鍵步驟是RNA的逆轉錄，cDNA的PCR條件與壹般PCR相同。由於引物的高選擇性，細胞的總RNA可以不經分餾直接用於RNA PCR。但RT-PCR對RNA產物的要求非常嚴格，作為模板的RNA分子必須完整，不含DNA、蛋白質等雜質。即使RNA中含有極少量的DNA，擴增後也會發生非特異性擴增；蛋白質未純化，與RNA結合會影響逆轉錄和PCR；殘留的RNA酶很容易降解膜RNA。硫氰酸胍(GaSCN)-CsCl法或酸性硫氰酸胍-苯酚-氯仿法可用於提取理想的RNA產物，尤其是後壹種方法，適用於壹般實驗室。
有兩種常用的逆轉錄酶，即禽成髓細胞瘤病毒(AMV)和莫洛尼鼠白血病病毒(莫-MLV)。壹般來說，Mo-MLV-RT應用廣泛，但當模板RNA的二級結構嚴重影響逆轉錄時，可以使用AMV-RT，因為後者的最適溫度為72℃，高於Mo-MLV-RT (37℃)，較高的反應溫度有助於消除RNA的二級結構。
壹步擴增是為了檢測低豐度mRNA的表達。使用相同的緩沖液，將逆轉錄酶、引物、Taq酶和四種dNTP加入到相同的系統中進行直接mRNA逆轉錄和PCR擴增。發現Taq酶不僅具有DNA聚合酶的功能，還具有逆轉錄酶的活性，可以在同壹個體系中以mRNA為模板直接進行逆轉錄和後續的PCR擴增，從而簡化了mRNA的PCR步驟，將所需樣本量降至最低，這對於臨床小樣本的檢測非常有利。壹步擴增可檢測總RNA中小於65438±0 ng的低豐度mRNA。該方法還可用於構建低豐度mRNA的CD-NA文庫和克隆特異性cD-NA，並可能與Taq酶測序技術結合，使自動逆轉錄、基因擴增和基因轉錄產物測序在壹個試管中進行。
最近，塞特斯公司推出了具有DNA聚合酶活性的rTth逆轉錄酶，極大地促進了RNA的發展。rTth逆轉錄酶方法參見第四節。
XI。定量PCR
1.DNA-PCR定量利用同位素標記的探針與電泳分離的PCR擴增產物雜交，模板DNA可根據放射自顯影後陰性的曝光強度進行定量。Abbot等人利用這種方法對人類T細胞白血病的逆轉錄基因進行了定量研究。
PCR擴增產物用專門設計用於檢測ds-DNA的熒光計定量，利用染料H33258特異性結合雙鏈DNA的特性，熒光增強50倍。從標準模板系列的稀釋擴增產物的體積曲線可以讀出樣品中模板DNA的量或拷貝數，達到PCR定量的目的。
用多個稀釋模板進行系列稀釋PCR，尋找最低檢測限(PCR-EB)進行比較，也是壹種常用的半定量PCR方法。
2.mRNA-PCR定量因為MRNA-PCR定量需要兩種酶(RT和Taq)催化，所以影響因素很多。1989王等報道了低豐度mRNA的絕對定量方法。利用已知濃度、與目標mR-NA序列相同的內參mRNA(其片段長度不同，便於PCR擴增後產物的分離)，在同壹系統中，用32P標記的同壹引物進行逆轉錄和PCR擴增。擴增產物電泳後，分別測量兩種產物的放射性強度，從預先制備的標準曲線計算出每種樣品的特異性mRNA的量。Gilliland等人的結果表明，在1ng的總RNA中，可以定量小於1pg的特異性mRNA。這種定量方法在腫瘤、代謝紊亂和基因表達調控的研究中具有重要意義。