測試試劑
PCR擴增雙鏈DNA模板
大約20個核苷酸長的DNA引物。
DNA聚合酶
測序凝膠
0.1摩爾/升滴滴涕
α-32P-dATP
DNTP/ddNTP混合物(80μmol/L/8μmol/L)
dntp(dctp、dGTP和dTTP分別為0.75μmol/L)
測序反應緩沖液:40mmol/L Tris-HCl(pH7.5)，20mmol/L MgCl2，50mmol/L NaCl。
終止緩沖液:95%甲酰胺、20mmol/L EDTA、0.05%溴酚藍、0.05%二甲苯腈。
測試步驟:
分別向1和4個微量離心管中加入2.5minμl dNTP/DD NTP混合物，並讓混合物在370°C下溫熱5分鐘。
2.將1pmol PCR擴增的雙鏈DNA、10pmol測序引物、2μl 5×測序緩沖液加入到空的微量離心管中，加入雙蒸水至總體積10μl，在96OC加熱8min，但冰浴是1min，4 oc是65438+。
3.加入2μl預冷的標記混合物(dCTP、dGTP、dTTP各0.75μmol/L)，α-32P-dATP 5μCi，1μL 0.1mol/L DDT，測序酶2U，加水至15μl，混勻，然後冰2min，標記新的。
4.在步驟1的四個試管中各加入3.5μl標記的反應混合物5ml，並在37℃下溫浴5分鐘。向每個試管中加入4μl終止溶液。
5.樣品在80℃水浴中變性5分鐘，在每個泳道的測序凝膠中加入2μl，通過電泳分離這些片段。
註意事項:
1.？PCR產物要有壹定的長度(>；200bp)，因為測序結果兩端20-30bp的電泳峰準確性較低。
2.？純化的PCR產物可以通過離子交換層析與剩余的dNTP和引物分離。PCR產物也可以通過瓊脂糖凝膠電泳與非特異性擴增產物和引物分離。如果擴增特異性高，可以直接用苯酚:氯仿提取，乙醇沈澱純化。
3.？測序引物的設計原理類似於PCR引物的設計原理。可在DNA合成儀上合成約20個核苷酸作為引物，經高壓液相色譜或聚丙烯酰胺凝膠電泳純化後可作為測序引物。
PCR循環測序法
PCR循環測序是將PCR擴增與核酸序列分析技術相結合的壹種確定核苷酸序列的研究方法，也稱為線性擴增測序。該方法通過PCR儀加熱使DNA模板變性，在TaqDNA聚合酶的作用下，以溫度循環方式對模板進行多輪雙脫氧核苷酸測序反應，線性擴增標記的DNA分子。
與以往的測序方法相比，PCR循環測序法的優點是所需的模板量大大減少；可以提高測序反應產生的信號，降低操作的復雜性，減少聚合酶的用量；可以在少量制備的模板上進行篩選反應；高溫下的測序反應使DNA聚合酶催化的聚合穿過模板的二級結構區域；雙鏈閉環DNA可以直接作為反應模板，無需事先堿變性。由於PCR循環測序法可以簡單、快速地檢測特定的序列，因此在核酸序列分析研究中得到了廣泛的重視。
測試試劑:
DNA測序試劑盒
dNTP
ddNTP
丙烯酰胺
雙丙烯酰胺
尿素
TEMED(N，N，N '，N'-四甲基乙二胺)
過硫酸銨
6%測序凝膠:6%丙烯酰胺，7mmol/L尿素，1×TBE。
10×測序緩沖液:100mmol/L Tris-HCl(pH8.8)，500mmol/L KCl，40mmol/L MgCl2，0.01%明膠，20μmol/L dATP，50μmol/L dCTP，50μmol/L
混合溶液的終止:ddtp(600 μm ol/L)，ddCTP (600μmol/L)，ddGTP (100μmol/L)，ddTTP(1000μmol/L)。
終止緩沖液:95%甲酰胺、20mmol/L EDTA、0.05%溴酚藍、0.05%二甲苯腈。
測試步驟
1，4個小離心管，向每個小試管中加入3μl終止混合物，並將試管置於冰上。
2.向DNA模板中加入引物(4pmol)、4 μ l的10×測序緩沖液、10 μ l的α-32p-Datp、2u的Taq DNA聚合酶，加入雙蒸水至30μl，充分混合，向上述四個小管中各加入7μl。
3.向反應溶液中加入30μl石蠟油。
4、95OC 30S、50OC 30S、72oC60s * * 30次循環，循環條件和循環次數可根據具體情況適當調整。
5.反應後，在油層下加入5μl終止緩沖液，用取樣槍混合。
6.上樣前，將樣品在80℃以上的水浴中熱變性5min，並向每條線的測序凝膠中加入2μl，然後通過電泳分離這些片段。
註意事項:
1.測序模板的制備:PCR擴增產物可用低熔點瓊脂糖凝膠電泳純化回收，用於序列分析；它可以通過柱層析純化，並在PCR反應後除去剩余的dNTP和引物後用於序列分析。PCR產物也可以不經純化直接用於測序，但這種測序產生的結果較差，建議在測序前對PCR產物進行純化。通過各種標準質粒制備方法純化的質粒可以用作測序模板。標準方法制備的M13噬菌體、粘粒和λDNA都適合作為測序模板。但需要註意的是，反應體系中不能有與引物互補的非靶基因序列，否則測序實驗會失敗。
2.測序引物:測序引物是指與測序模板鏈特異互補的合成寡核苷酸序列。引物的5’端可以用α-32P-dATP和T4多核苷酸激酶標記，反應體系中引物、激酶和α-32P-dATP的比例應保持在最佳，以獲得高比活性的標記引物。新合成的DNA鏈也可以用α-32P-dATP標記。引物濃度不宜高，否則容易形成引物二聚體或產生非特異性擴增引物。
3.酶:各種缺乏3'-5 '核酸外切酶活性的耐熱DNA聚合酶均可用於循環測序，其中TaqDNA聚合酶是DNA測序中最常用的。盡管應用PCR循環測序法可以簡單快速地確定基因序列，但仍不能滿足大規模DNA測序的需要，PCR循環測序法、熒光標記和自動測序儀的結合已成為大規模基因組測序的主要技術。該技術使用熒光標記引物或雙脫氧核苷三磷酸，反應產物經聚丙烯酰胺凝膠電泳，再用特定的DNA序列分析儀和分析系統處理待測DNA序列。它的應用減少了DNA測序的工作量，提高了測序的效率。