目前發現可以用於藥物治療的免疫檢查點分子有很多:PD-1、PD-L1、CTLA4、LAG-3、Tim-3、TIGIT、PV Rig、NKG2A等。，因為PD-1/PD-L1和CTL A4是最早的。但這種聯合方式在很多腫瘤患者身上效果並不明顯，而且還有很強的副作用。因此，近年來科學家們也在不斷研究其他免疫檢查點的聯合用藥方法。TIM-3廣泛表達於T細胞、Tregs、B細胞、NK細胞、DC、巨噬細胞、肥大細胞等多種免疫細胞，與Galectin9、高遷移率盒1( HMGB1)、癌胚抗原1( CEACAM-1)相關。此外，TIM-3和PD-1在衰竭T細胞和til上的共表達為抗PD-1和抗TIM-3的聯合應用提供了新的思路。壹些小鼠模型實驗為這種組合的有效性提供了直接證據。在晚期和轉移性實體腫瘤中進行了幾項I期抗PD-1聯合抗TIM-3研究。
那我就先通過解讀，在今年的NAT Commun (if: 14.438+0)上發表。壹篇題為:Galectin-9與PD-1和Tim-3相互作用調節細胞死亡，是癌癥免疫治療的靶點的文章，介紹了分子夫婦PD-1/TIM-3和Galectin-9在免疫檢查站的三角戀故事。
1.質譜法篩選PD-1結合蛋白。
首先，研究人員通過免疫復合物的IP/Western和質譜分析，證實Galectin-9是PD-1的結合蛋白，具有免疫調節活性。在這裏，妳可能需要想到，作者壹定是篩選了很多能與PD-1結合的蛋白質，然後通過實驗逐壹驗證了它們的功能。最後發現Galectin-9蛋白有很好的表型，所以後面分析了所有的蛋白。以此類推，我們也可以篩選與自己研究基因結合的蛋白質，從而縮小靶基因的範圍。隨後的實驗證明，半乳糖凝集素-9與PD-1的結合是高度選擇性的，並且是由多糖介導的。它不影響PD-1與其同源配體PD-L1的結合，也不影響PD-1與治療性抗體Pembrolizumab和nivolumab的結合。
半乳糖凝集素-9主要有兩個CRD (N-CRD，C-CRD)結合位點。研究人員發現，半乳糖凝集素-9主要通過其C-CRD與PD-1結合，而N-CRD和C-CRD都介導其與Tim-3的結合。為了確定PD-1上與半乳糖凝集素-9結合的糖基化位點，將PD1上四個可能的糖基化位點(N49、N58、N74和N116)中的天冬酰胺殘基(N)分別突變為谷氨酰胺(Q)。發現N116Q的突變極大地影響了PD-1與Gal-9的結合，因此Galectin-9/PD-1的相互作用主要由Gal-9的C-CRD和PD-165438組成。
圖1:
2.Galectin-9能與PD-1和TIM-3交聯形成復合物。
然後，研究人員發現，在沒有半乳糖凝集素-9的情況下，PD-1 ECD不與TIM-3 ECD結合，但半乳糖凝集素-9促進了它們的協同結合。DuoLink實驗和IP/Western實驗的結果進壹步證實了這壹點。但神奇的是，PD-1/TIM-3的相互作用可以在沒有外源性Galectin-9的情況下檢測到，這種作用不受乳糖或PD-1 N116Q突變的抑制。就好像PD-1/TIM-3本來是壹對情侶，但是關系不是很穩定。這時，生活中出現了壹個能和他們兩人相處的好朋友Galectin-9。表面上是為了調整他們之間的關系，實際上是和其中壹個人曖昧。
圖2:
3.Galectin-9可作為腫瘤免疫治療的靶點。
通過流式細胞儀分析，研究人員發現Galectin-9誘導的T細胞死亡可能與抗癌免疫抑制有關，因此研究人員評估了抑制Galectin-9在癌癥治療中的潛力，並推測這可能是由於抑制Galectin-9後T細胞共刺激受損。然後將抗Galectin-9與GITR(TN frsf共刺激受體家族成員)的興奮性抗體DTA-1結合，驗證了這壹想法。它們的組合協同抑制了腫瘤的生長並延長了不同腫瘤模型的總存活時間。因此，這些結果表明Galectin-9是腫瘤免疫治療的靶點，抗Galectin-9與GITR激動劑聯合應用可誘導較強的抗腫瘤活性。
圖3:
4.質譜流程證實，抗半乳糖凝集素-9治療是針對特定的腫瘤浸潤性T細胞亞群。
只有推測，當然沒有動物實驗是做不到的。研究人員隨後在荷瘤小鼠體內進行了實驗。通過對質譜結果的分析，研究人員發現，抑制Galectin-9可以選擇性地擴大腫瘤中TIM-3+ CD8T和CD4T細胞的亞群，包括免疫抑制的Treg細胞，Treg細胞占總CD45+TIL的比例增加，特別是CD8T細胞中CD8T_1亞群的比例在抗Galectin-9治療後增加了兩倍以上。由於Treg能特異性抑制抗腫瘤免疫，聯合抗Galectin-9和抗GITR(能特異性下調Treg)，CD8T亞群比例進壹步增加，而Treg細胞幾乎完全喪失。因此，抗半乳糖凝集素-9單壹療法擴增了具有有效潛力的CD8T細胞亞群。然而，其治療效果可能受到Treg細胞共擴增的影響。
圖4:
正常情況下，CD8T細胞在腫瘤抗原的不斷刺激下，會逐漸喪失功能，成為衰竭的前體細胞。在這個階段，CD8T細胞會高度表達TCF1，也會表達PD-1和Tim-3。如果腫瘤抗原持續存在，CD8T細胞會走向終末衰竭T細胞，逐漸死亡。而這種終末衰竭T細胞狀態之前的T細胞，通過抗Galectin-9處理，可以逆轉為具有較強增殖分化能力的功能性T細胞，但同時Treg細胞也在擴增。因此，結合抗GITR來控制Treg細胞的擴增解決了這壹問題。
圖5:
5.單細胞數據揭示了半乳糖凝集素-9的表達和分布。
其實說到這裏，文章的主要研究思路已經講完了，但是為了進壹步分析Galectin-9在各種免疫細胞中的表達，作者還分析了壹組之前發表的單細胞數據。因此，這進壹步說明了數據挖掘的重要性。再先進的研究思路，也需要大數據作為支撐，才能變得更有說服力。這些數據可以來自自費測試或發表的研究。在這裏，作者通過數據挖掘發現Galectin-9(LGALS9)在各種免疫細胞中均有表達，發現有反應的患者比PD-1治療無反應的患者表達更高水平的Galectin-9，這也證實了抗Galectin-9和抗PD-1藥物聯合應用的可能性。
圖6:
6.關於免疫應答研究的壹些想法。
好了，以上介紹了如何通過實驗研究免疫檢查點分子間的相互作用來探索影響腫瘤免疫治療應答的因素，學習壹些實驗設計的研究策略。不過為了符合我平時的寫作氣質，我還得給妳點別的有意義的幹貨。事實上，作為數據挖掘的壹個熱點，關於腫瘤對免疫治療的反應有很多想法。以下是今年剛剛發表的關於免疫療法研究的壹些想法:
圖7:
第壹篇文章是發表在Molther Oncology雜誌(if: 7.20)上的壹篇題為“單細胞RNA測序分析師識別CD8+t細胞亞群的異質性和黑色素瘤的新治療靶點”的文章。作者重新分析了已發表的黑色素瘤單細胞數據，揭示了七組CD8 T細胞亞群，它們具有不同的特征。此外，作者還確定了三個基因(PMEL、TYRP1和EDNRB)在衰竭的CD8 T細胞中過表達，它們與患者的不良預後顯著相關。像這種想法，只要有數據，就可以輕松復制。至於發什麽樣的雜誌，要看確認的發現是否新穎。
圖8:
另壹篇發表在吉蒙其他癌癥(if: 13.75)的文章題為:cxcl13塑造免疫活性腫瘤微環境，增強PD-1check poi的效率。高級別漿液性卵巢癌NT阻斷的文章從影響免疫浸潤的趨化因子入手。這個思路主要是探索星形分子在不同癌癥類型中的作用，還需要實驗來驗證。因為明星分子已經研究了很多，基本上很難做出什麽太新奇的東西，除非做泛癌分析。但這類實驗的設計非常簡單，只需要證明壹個明星分子在特定癌癥類型中是如何影響免疫治療反應的。
圖9:
如果妳覺得明星分子的研究沒有太多新意，當然也可以通過各種生成字母的方法篩選出關鍵基因。下壹篇發表在Onco immunology(if:8.11)上的文章題為《YKT6作為口腔鱗狀細胞癌預後和免疫治療反應的潛在預測因子，與細胞侵襲、轉移、CD8+ T細胞浸潤有關》是先用WGCNA方法篩選出與免疫抑制有關的基因YKT6，再進行後續分析。更容易講述這個新篩選的基因的故事，以前沒有報道過。當然，這種想法帶有壹些運氣的成分，很有可能是苦心經營篩選出來的基因要麽功能不好，要麽已經被報道了。
圖10:
如果妳沒有很強的腫瘤免疫的生物學背景知識，沒有很好的實驗平臺，那麽還有壹個最終的選擇，那就是萬能膏藥的臨床預測模型。最後壹篇發表在《前沿免疫》(IF:7.56)雜誌上。題為“與IFN-γ激活的CD8+T細胞浸潤相關的9-基因簽名:黑色素瘤免疫檢查點治療反應的生物標誌物”的文章旨在構建壹個與免疫治療相關的臨床預測模型。臨床預測模型的構建現在已經非常成熟，如LASSO、COX、NMF等模型都可以應用。這個想法的前提是找到壹個相對新穎的切入點，最後能夠得到多組數據集的驗證，那麽基本上就可以發表壹篇好的SCI文章了。
7.摘要
本文研究了腫瘤免疫治療應答的科學問題。先通過壹篇實驗研究文章，說明如何通過巧妙的實驗設計篩選潛在的免疫檢查點分子，然後分別解讀純實驗和組合實驗的壹些思路。關於腫瘤免疫治療的方向有很多，但壹般需要先了解腫瘤類型的免疫治療進展。有些問題在某些癌癥類型中已經研究得很透徹了，沒必要浪費時間，同樣的科學問題在某些腫瘤中還是未知的，所以這樣的問題更有研究價值。此外，如開頭所述，是否涉及免疫治療應答的問題主要與免疫細胞的比例有關，腫瘤中免疫細胞的比例並不高，所以bulk檢測到的高表達基因主要是腫瘤細胞本身的基因。從這個角度來說，基於批量數據差異分析發現的高表達基因，需要用腫瘤細胞系的實驗來驗證。而單細胞數據更有利於揭示免疫細胞和免疫治療上表達的基因，但在10X的商業平臺上可以測量的基因並不多。我的經驗是從單細胞數據中揭示各種免疫細胞的比例，找出有反應和無反應的不同免疫細胞亞群，進壹步找出高表達的基因。最後通過簡單的實驗來驗證免疫細胞的功能，基本上就可以發表壹篇好文章了。
更多精彩文章，歡迎關註信人微信官方賬號。
最新的文獻可以免費獲得。歡迎關註醫學小程序。