聖約翰大學創建於1879年9月1日，原名是聖約翰書院，是由美國聖公會上海主教施約瑟(S. J. Sekoresehewsky)將原來的兩所聖公會學校培雅書院和度恩書院合並而成，在滬西梵皇渡購地興辦。於4月14日破土動工，9月1日開學招入第壹期學生。辦學初期設西學、國學和神學三門，上海方言授課，1881年學校的英語老師蔔舫濟牧師（F. L. Hawks Pott）開始完全用英語授課，這是中國首個全英語授課的學校。1888年6月，年輕的蔔舫濟出任校長，此後主持聖約翰校務長達52年之久，對聖約翰的發展起到了很大的影響。
1892年起學校正式開設大學課程，並且將英語作為最重要的學科教授。1896年學校形成文理科、醫科、神學科及預科的教學格局，為滬上唯壹高等學府，對東南地區高等教育的改革產生深遠影響。1905年，學校成為正式的大學，並在美國華盛頓州註冊，大學設文學院、理學院、醫學院、神學院四所大學學院以及壹所附屬預科學校，成為獲得美國政府認可的在華教會學校。此時的聖約翰已經初具規模，擁有了壹座1884年美國紐約克拉克遜女士巨額資助興建的教堂，後經重建成為該校禮堂兼聖公會教堂（80年代末該教堂被拆除後改建為華東政法學院圖書館），壹座1894年建造的以創辦人名字命名的中國式教學樓“懷施堂”（90年代初該堂改稱“韜奮樓”）和另壹座1903年用庚子賠款所建起來的“思顏堂”（紀念學校的第二任校長中國籍牧師顏永京先生）。1913年，聖約翰大學又開始招收研究生，1936年開始招收女生，後來發展成為壹所擁有六個學院（文學院、理學院、醫學院、工學院、神學院、農學院）十六個系的綜合性教會大學，是當時上海乃至全中國最優秀的大學之壹，入讀者許多多是政商名流的後代或富家子弟，而且擁有很濃厚的教會背景。學校直到1947年才向國民政府註冊。
創辦之初
聖約翰大學是近代中國著名的教會大學之壹，原為聖約翰書院，由美國聖公會主教施約瑟1877年開始籌建，1879年正式開學。 最初，為了吸引學生和擴大影響，該學校免收學雜費，而且免費提供住宿和其它生活用品。1888年聖公會傳教士蔔舫濟開始擔任校長，直到1942年退休。
學校最初設國文和神學兩部，1880年設醫學部，1881年設英文部。在教學特色上，該校尤其重視英文學習，是學生的必修課，而且課堂大部分用英文授課。由於該大學的學生英文水平在全國是最好的，因此受到用人單位的歡迎。
1896年，聖約翰書院經改組、擴建，成立由文理、醫學和神學三科組成的大學部。20世紀後，聖約翰大學在提高教學質量，擴大辦學規模方面了很大努力，先後建成文學院、理學院、醫學院、神學院四個相對獨立的學院。1906年以後，它的畢業生還可以進入美國的大學深造，所以吸引了大批學生。1923年增設土木工程學院。20世紀40年代中期，聖約翰大學的規模又進壹步發展。
“六三”愛國壯舉
1925年，五卅慘案在上海爆發，各界紛紛走上街頭。聖約翰大學及附中的師生也組織罷課抗議，但遭到校方阻撓。於是6月3日，學生553人以及全體華籍教師19人，集體宣誓脫離聖約翰大學，10余名應屆大學畢業生聲明不接受聖約翰大學頒發的畢業文憑。這壹日便定為光華大學的校慶日。6月4日，離校學生教師集會商議自行設校事宜，他們的舉動受到社會各界和學生家長們的支持，出錢出地；連張學良將軍都表示“事出愛國熱忱，鄙人無不竭力援助”，願捐出巨款，助光華壹臂之力。經過各方協助，在短短三個月內就成立了新的“光華大學”，其1951年10月與大夏大學合並組建華東師範大學。
解放初期，約大師生為紀念1925年該校的“六三”愛國壯舉，將校園內的斐蔚堂改名為“六三樓”。1998年大修後改為行政辦公用房。
解放後
1950年12月，聖約翰大學正式宣布與美國聖公會脫離關系。1952年在全國院系調整中被拆散並入上海多所高校。原校址所在地是華東政法大學長寧校區，地址是上海萬航渡路1575號。
1949年前，聖約翰大學農學院停辦，部分學生轉入金陵大學和嶺南大學的農學院。解放後，聖約翰大學被分拆的詳細情況如下：1949年～1952年聖約翰大學新聞系、外文系、中文系（部分）並入復旦大學。1951年聖約翰大學土木工程系、建築工程系並入同濟大學。1952年聖約翰大學機械工程系並入交通大學；聖約翰大學經濟系並入上海財政經濟學院（今上海財經大學）；聖約翰大學政治系並入華東政法學院（今華東政法大學）；聖約翰大學理學院（數學系、物理系、化學系、生物系）、教育系、中文系（部分）並入華東師範大學；聖約翰大學醫學院參與組建上海第二醫學院，後更名為上海第二醫科大學（今上海交通大學醫學院）；取消神學院，學生轉入南京的宗教學校；聖約翰大學附中與大同大學附中二院合並為上海市五四中學。