另外，有時疾病易感基因本身表達並無改變，而是通過調控其它基因發揮作用。所以，致病基因的尋找應從多種途徑著手。
壹孔之見，如有謬誤之處，請大家指教。 多謝verygood 兄，我的第壹步可能只能做到表達譜的改變這壹層次，如果有機會做下去的話，如妳所言，應該從各種途徑全面考慮。我現在的想法是以表達譜基因芯片技術為核心方法，做出患者和正常人小梁細胞基因表達譜的差異的總體信息，如maxon和妳所說，這樣可能找到新的致病相關基因，也可能不行，我想著起碼是壹個方面吧（不知對不對）。 我目前所能考慮的是如何組織自己的思路，來吧這個工作做好。還有幾個問題請教：
1.基因文庫的建立方法中，比如有壹篇文章中選了1118個基因進行研究，通過BLAST，分成了已知基因、已知序列、未知基因等幾類，我不明白他們是如何從基因文庫（提取細胞全mRNA逆轉錄來的)中選定的?(還是從別的地方查到的?)，我理解好像是直接測序，請問是如何從基因文庫中找出（分離）這些基因壹壹測序的？
2.如何使用BLAST？比如同壹文章中所說的已經測定出的1118個小梁細胞的表達譜基因序列我如何能查到？能給我講解壹下嗎？太感謝了
有沒有註意到壹個問題,基因芯片只能檢測已知的基因或序列,對於那些未知的則無能為力,壹孔之見. Andrew說得不錯，不過芯片中的基因數也在隨對基因研究的深入而在不斷增加。對普通的研究來說，主要的已知通路基本已能包括。 多謝指教。有能回答我上面幾個問題的嗎？我還是有些不明白，看了壹天資料也沒有明白。
請問：如果我用壹個正常群體的基因表達譜cDNA定做了壹個芯片（含已知的1118個基因），在與患者cDNA樣品的雜交中發現有壹個基因表達下調了或者不表達，其原因是什麽呢？是真的沒有表達還是別的？
多謝多謝 樣本是否壹致？比如血細胞，其細胞亞群是否有可比性？
有對照嗎？ 樣本是隨機樣本，小梁細胞是均壹的內皮細胞。至於對照，妳指的是陰性對照、陽性對照還是轉錄的內對照？
小弟所知甚少，低級錯誤也可能犯，請多多指教。 除去實驗和DNA芯片誤差外，在與患者cDNA樣品的雜交中發現有壹個基因表達下調了或者不表達，需要用RT-PCR進行驗證。其表達的下調或不表達，可能是受到其上遊基因的調控，也可能是基因本身結構有改變，如無義突變可檢測到表達的下降。對這些經RT-PCR證實後，應該進行測序，察看這些基因是否有結構的異常。 在天天站長和各位戰友的幫助下，我對現在所申請的課題從無知到略懂，終於完成了自然科學基金申請書的寫作，在明天，我們的這份凝結著大家的汗水和智慧的申請書就要送出去之前，對各位這幾天來的幫助表示誠摯的感謝，盡管這是我第壹次寫這樣的申請，盡管幾乎沒有中的可能，我還是覺得自己學到了很多東西，也結識了很多好朋友，真誠的感謝給了我這個機會！
我把這份申請的正文部分放在了附件裏了，希望感興趣的朋友可以看壹下，提壹些寶貴意見，因為我認為這樣的壹個課題還是很值得去做的，盡管我們可能沒有這個機會和能力去做。
再次感謝大家啦！
88411-.doc</A> (76.5k) 恭祝申請成功！！ 謝謝天天站長的指教，謝謝各位戰友。
近日科研基金開始申報，老板急命申請課題。由於對基礎剛剛接觸，故請教站長以及各位戰友。
1目前收集到壹少見的單基因病（癲癇方面），在國內未見臨床和基礎報道。臨床工作，包括留取血樣已經完成。
2本病自從98年以來，致病基因得到了定位和克隆，但存在遺傳異質性，相同的致病基因的突變位點也不相同。多篇文章發表在nature genetic等權威雜誌上。最新的研究顯示，仍有其他未知的致病基因。
3合作實驗室，有曾經成功的定位和克隆了壹例致病基因的經驗。
我們申請的目的是致病基因的定位和克隆，並有望發現新的致病基因。
想請教各位：
1在目前僅僅掌握臨床資料的情況下，能否提出申請？
2還需要做那壹方面的工作？
2如果可以，可能申請失敗的原因是什麼?
謝謝各位，急切盼望指教！謝謝 如果是單基因疾病，那要看妳收集的家系怎麽樣了。另壹個問題主要是妳的臨床診斷正確與否。我不是臨床的，這個臨床診斷事關重大，如果有些是診斷錯誤或分型有誤的，很有可能導致無法discover disease gene 單基因疾病這方面的技術策略已經很成熟，有很多文獻可以參考。國內也有多家研究機構在做。 我想研究下某個基因SNP與壹種疾病的關聯。國外已有報道在2個位點上有聯系。那麽我是進行RFLP分析，還是用SNP分析？ 各位大俠，我最近在做壹個X染色體連鎖遺傳家系的疾病相關基因的定位，現在已用兩個位點的MARKER(STR)做了基因組掃描，但是在連鎖分析時遇到了困難，我用的是LINKAGE(version 5.1). 我想請教各位在進行連鎖分析時，性連鎖與常染色體連鎖遺傳參數設置有何不同？急盼各位予以賜教，不勝感激！ 答無事轉轉 我想研究下某個基因SNP與壹種疾病的關聯。國外已有報道在2個位點上有聯系。那麽我是進行RFLP分析，還是用SNP分析？
RFLP是最早期的遺傳標記(第壹代)，隨著遺傳學的發展和測序片段的不斷增多，已出現了第二代、第三代遺傳標記。RFLP通過酶切作用進行分析，操作簡單，花費不多，但特異性差，有被淘汰的趨勢；SNP定位明確，相對花費較大，對其分析可以通過測序、小測序(Snapshot)、熒光探針、SNP芯片等方法。
具體行RFLP分析，還是用SNP分析看妳的研究目標和經濟實力。 請教verygood，能否介紹壹下小測序（snapshot）？
我最近想檢測某基因與疾病的關系，外顯子較多（20），在其他疾病中已有突變熱點（9、11、13、17exon），但我要研究的病未見報道。請問我應對所有外顯子測序嗎？ coldant wrote:
請教verygood，能否介紹壹下小測序（snapshot）？
我最近想檢測某基因與疾病的關系，外顯子較多（20），在其他疾病中已有突變熱點（9、11、13、17exon），但我要研究的病未見報道。請問我應對所有外顯子測序嗎？
Snapshot為小測序反應，其原理簡單地說是首先擴增包含SNP在內的壹段DNA模板，再對PCR產物進行純化，加入帶有不同熒光的ddNTP和中間探針（所謂中間探針即SNP前20個bp左右寡核苷酸序列，探針與ddNTP按照模板序列結合，因為是ddNTP，其後不能再延伸，而結合的ddNTP反應的就是SNP情況），再純化壹下進行電泳，根據不同的熒光可以判斷相應SNP基因型。
該方法適用於對已知SNP等位基因型進行確認，對探針要求不高；但操作步驟多，大規模應用較為困難（采用基於毛細管的測序方法，如ABI3100測序儀系列時，相對工作量小些）。
檢測某基因與疾病的關系，外顯子較多（20），在其他疾病中已有突變熱點（9、11、13、17exon），建議妳先研究壹下這些位點。當然如果基因序列很短，也可以直接測序，因為目前發現的SNP或mutation畢竟還只有預計值的2%左右。
Good luck 謝謝verygood：）
最近忙著論文答辯的事情。我對於這方面完全是菜鳥，但是老板說要有新意，同學給出了個這樣的主意。
目前已經提取DNA，進行基因分型。但是我希望測序進行確定。上面提到的SNAPSHOT是小型測序，我已經確定了突變位點，片段在300bp左右，是否可以全部測序？
另外是全部的樣本測序還是就挑選幾個雜合子和純合子測就可以證明？這方面的資料在哪裏有介紹？我還是新手：（ 無事轉轉 wrote:
謝謝verygood：）
最近忙著論文答辯的事情。我對於這方面完全是菜鳥，但是老板說要有新意，同學給出了個這樣的主意。
目前已經提取DNA，進行基因分型。但是我希望測序進行確定。上面提到的SNAPSHOT是小型測序，我已經確定了突變位點，片段在300bp左右，是否可以全部測序？
另外是全部的樣本測序還是就挑選幾個雜合子和純合子測就可以證明？這方面的資料在哪裏有介紹？我還是新手：（
如果只是300bp，且標本不多的話，還是直接測序好，因為不僅可以明確已知的SNP基因型，還可能順帶發現壹些文獻未報道過的，這也就是說所有標本都要測序。
如果只想對已知的那些SNP進行基因分型，妳可以采用SNAPSHOT方法，當然亦可以用RFLP，只是特異性差些，所得的條帶不壹定與目標SNP不同等位基因有關，可能切到染色體其他區域。
這方面到沒有壹定的資料，我們也是做過以後才逐漸理解的，具體采用何種技術還是因地制宜吧。 verygood wrote
檢測某基因與疾病的關系，外顯子較多（20），在其他疾病中已有突變熱點（9、11、13、17exon），建議妳先研究壹下這些位點。當然如果基因序列很短，也可以直接測序，因為目前發現的SNP或mutation畢竟還只有預計值的2%左右。
謝謝verygood老師。我研究的基因編碼區2930bp，mRNA5084bp，基因全長80kb。本打算直接測序，但病人組18例（石蠟），對照組20例（外周血DNA行嗎？），費用可能要6萬！！！，所以現在想改成PCR-SSCP加異常條帶測序，您看行嗎？ verygood wrote:
如果只是300bp，且標本不多的話，還是直接測序好，因為不僅可以明確已知的SNP基因型，還可能順帶發現壹些文獻未報道過的，這也就是說所有標本都要測序。
如果只想對已知的那些SNP進行基因分型，妳可以采用SNAPSHOT方法，當然亦可以用RFLP，只是特異性差些，所得的條帶不壹定與目標SNP不同等位基因有關，可能切到染色體其他區域。
這方面到沒有壹定的資料，我們也是做過以後才逐漸理解的，具體采用何種技術還是因地制宜吧。
測序以後的結果要分析突變有什麽軟件檢測呢？另外的統計學分析是不是有專門的生物統計學書有相關的介紹？還是就是普通的統計就可以了？ To coldant ：
對於初步研究，您的方法應該可行。
To 無事轉轉：
測序以後的結果分析突變主要通過序列比對初篩，可以利用Blast進行。不過確定是否確實為突變需要謹慎，應擴大樣本再進行分型研究。 作疾病相關研究，妳的case 和control太少了。壹般國內期刊好像也要200對200，國外壹般性期刊需要400-500對500左右。壹流的雜誌壹般都是至少1000對1000的。由於妳經費不足，妳不可能作測序，妳還是直接選用已知的位點做。因為這個基因跟多種疾病相關，說明這個基因很保守，很有可能跟妳所研究的疾病相關，就算沒有相關，通過與年齡、性別、該疾病的危險因素綜合分析（就是玩數字遊戲），壹般總能發文章的。
尋找疾病相關基因的SNP，目前主要是直接測序（外周血抽提的DNA，而不是組織），通過對比病人和正常人（無該疾病的人）該基因序列，搜尋SNP。verygood所說的blast，實際上並不適用。
妳可對目標SNP所在區域設計壹對prime1，使得該SNP位於其中,PCR長度500bp左右。同時在PRIMER1覆蓋的區域內，再設計壹對PRIMER2。PRIMER2其中壹個引物的3‘最後壹個堿基必需是與目標SNP所在位點的正常堿基互補，如此，若病人在此位點突變，將導致PRIMER2壹對引物不能擴增。另外PRIMER2與PRIMER1至少相距100多bp,PRIMER2產物為200多BP。這樣，在壹個PCR反應中同時放入這2對引物，就可以得到4個片段（在設計引物時，必須使得這4個片段的長度不同，以便電泳時區別），而含有目標SNP的個體，則只有3個片段，通過電泳，就可以確定是否該個體有突變。
這個方法具體的名稱我忘了。希望能對妳有所幫組。 maxon wrote:
尋找疾病相關基因的SNP，目前主要是直接測序（外周血抽提的DNA，而不是組織），通過對比病人和正常人（無該疾病的人）該基因序列，搜尋SNP。verygood所說的blast，實際上並不適用。
妳可對目標SNP所在區域設計壹對prime1，使得該SNP位於其中,PCR長度500bp左右。同時在PRIMER1覆蓋的區域內，再設計壹對PRIMER2。PRIMER2其中壹個引物的3‘最後壹個堿基必需是與目標SNP所在位點的正常堿基互補，如此，若病人在此位點突變，將導致PRIMER2壹對引物不能擴增。另外PRIMER2與PRIMER1至少相距100多bp,PRIMER2產物為200多BP。這樣，在壹個PCR反應中同時放入這2對引物，就可以得到4個片段（在設計引物時，必須使得這4個片段的長度不同，以便電泳時區別），而含有目標SNP的個體，則只有3個片段，通過電泳，就可以確定是否該個體有突變。
這個方法具體的名稱我忘了。希望能對妳有所幫組。
呵呵，我指的是借用blast來方便序列的比對，當然applied biosystems有更好的軟件，不過您如未購買相應儀器則很難獲得。
至於標本量的多少，確實是越多越好。對於相對危險度為2的致病位點來說，case-control各1000例檢測效能才能達到100%，病例數減少則檢測效能也隨之降低。但對於初步研究，還不清楚該位點是否有研究疾病有關就大規模投入，有可能顆粒無收。
供參考。 今天基康公司建議我直接測序，把樣本4個壹組形成壹個“pool？”來測，節省經費。他們本來的建議是正常和病人各用4例分別形成1個“pool”來找SNP，然後用公司的TAG MAN（壹種新技術）大規模檢測SNP，但我沒有這麽多病人標本。所以只好只是測序。
請大俠看看這樣好嗎？如果我總***25例病人分成6個“pool”測序再分析可以嗎？
先謝謝了。 maxon wrote:
尋找疾病相關基因的SNP，目前主要是直接測序（外周血抽提的DNA，而不是組織），通過對比病人和正常人（無該疾病的人）該基因序列，搜尋SNP。verygood所說的blast，實際上並不適用。
妳可對目標SNP所在區域設計壹對prime1，使得該SNP位於其中,PCR長度500bp左右。同時在PRIMER1覆蓋的區域內，再設計壹對PRIMER2。PRIMER2其中壹個引物的3‘最後壹個堿基必需是與目標SNP所在位點的正常堿基互補，如此，若病人在此位點突變，將導致PRIMER2壹對引物不能擴增。另外PRIMER2與PRIMER1至少相距100多bp,PRIMER2產物為200多BP。這樣，在壹個PCR反應中同時放入這2對引物，就可以得到4個片段（在設計引物時，必須使得這4個片段的長度不同，以便電泳時區別），而含有目標SNP的個體，則只有3個片段，通過電泳，就可以確定是否該個體有突變。
這個方法具體的名稱我忘了。希望能對妳有所幫組。
呵呵，謝謝了。我在相關文獻上看到的是設計2個引物（突變和未突變的），另外反義引物相同。正常對照組設計的引物很象妳所談到的PROMER2。我就納悶為什麽這樣做？ verygood wrote:
To 無事轉轉：
測序以後的結果分析突變主要通過序列比對初篩，可以利用Blast進行。不過確定是否確實為突變需要謹慎，應擴大樣本再進行分型研究。
確定是不可能做出結論，只是提出個展望。測序以後可以用SEQUENCEMAN軟件分析，但是後面我想加個RFLP，按照相關文獻報道來進行。這樣分析起來好象就有更多的數據支持。 coldant wrote:
今天基康公司建議我直接測序，把樣本4個壹組形成壹個“pool？”來測，節省經費。他們本來的建議是正常和病人各用4例分別形成1個“pool”來找SNP，然後用公司的TAG MAN（壹種新技術）大規模檢測SNP，但我沒有這麽多病人標本。所以只好只是測序。
請大俠看看這樣好嗎？如果我總***25例病人分成6個“pool”測序再分析可以嗎？
先謝謝了。
呵呵，妳也是在基康做嗎？他們好象是用探針來檢測SNP啊。我聽說探針的準確性不如直接測序。不知道他們和妳提出的是什麽樣的建議？：） maxon wrote:
作疾病相關研究，妳的case 和control太少了。壹般國內期刊好像也要200對200，國外壹般性期刊需要400-500對500左右。壹流的雜誌壹般都是至少1000對1000的。由於妳經費不足，妳不可能作測序，妳還是直接選用已知的位點做。因為這個基因跟多種疾病相關，說明這個基因很保守，很有可能跟妳所研究的疾病相關，就算沒有相關，通過與年齡、性別、該疾病的危險因素綜合分析（就是玩數字遊戲），壹般總能發文章的。
5555555，可是我收集不到這麽多的病例呀，經費也有限。
您說的直接做已知位點是什麽方法啊？另外您有看過《生物學統計》這樣的書嗎？聽說參照它就可以進行相關的分析了。上海哪個圖書館或是書店有呀？ 具體什麽方法我忘了。統計學主要就是T檢驗和X2 多態性分析方法有兩大類：
其壹，基於家系分析，主要采用連鎖不平衡方法。
其二，基於case-control，如maxon所言，主要就是T檢驗和X2 。但是應註意control是否能代表所抽樣的群體。因抽樣錯誤而導致的假陽性結果在早期文獻中比比皆是，這已逐漸引起大家的關註。 無事轉轉wrote：
呵呵，妳也是在基康做嗎？他們好象是用探針來檢測SNP啊。我聽說探針的準確性不如直接測序。不知道他們和妳提出的是什麽樣的建議？：）
看樣子無事轉轉做的工作與我的很相似，可以多多交流！
基康公司建議：病人與對照各25例（病人只收集到25例），4例壹組形成壹個“pool”，PCR擴增所以外顯子，直接測序。（節省費用）
申能公司建議：對每個病人進行擴增，直接測序，與genbank比較（不設對照組，費用18000元/10例）
北京鼎國公司：PCR-SSCP，（正常，病人各25例）
請verygood，maxon，無事轉轉等戰友們參謀參謀，哪個可行？
申請斑竹們幫助。 coldant wrote:
看樣子無事轉轉做的工作與我的很相似，可以多多交流！
基康公司建議：病人與對照各25例（病人只收集到25例），4例壹組形成壹個“pool”，PCR擴增所以外顯子，直接測序。（節省費用）
申能公司建議：對每個病人進行擴增，直接測序，與genbank比較（不設對照組，費用18000元/10例）
北京鼎國公司：PCR-SSCP，（正常，病人各25例）
請verygood，maxon，無事轉轉等戰友們參謀參謀，哪個可行？
申請斑竹們幫助。
我病例30，對照12。人家的建議是直接測序。我想測序以後再做個RFLP，因為是要寫論文，所以內容不可以少。